由于灰指甲的真菌种类繁多，所以只依靠直接镜检法来鉴别真菌比较困难，有时候真菌菌丝在病甲中数量少，不容易找到，所以，有时还要进行免疫组织化学染色法，免疫组织化学染色法也是组织病理学检查灰指甲的一种方式，该方法能够清楚的观察到甲组织是腐生菌的污染还是病原菌的侵袭。在灰指甲的领域里，采用免疫组化的方法来检查标本可以针对特异的单克隆抗体获得肯定的诊断。通过免疫组化法，可以针对不同真菌特异性抗体的测定也证实了混合感染确实存在。
一、检查灰指甲的直接镜检法：
1.氢氧化钾液制备标本的方法
采集标本的方法和注意事项，之前已经做了详细的阐述，这里就不重复介绍了。将刮取的甲屑置于清洁的玻璃载片上，加1-2滴10%-20%的氢氧化钾溶液，加盖玻片后微微加热，有助于溶解角蛋白和排出玻片之间多余的气泡，但一定要注意不要过度加热，以免因溶液烧干而形成结晶。待角质层细胞溶开、变薄后即可镜检，在取下的标本中可以找到菌丝和孢子，也可以看见假菌丝或着色的芽胞等。甲屑标本在氢氧化钾液真菌镜检后，根据所见到的不同菌丝、孢子的结构大致可以考虑由某种真菌感染引起灰指甲。有时候，一次镜检或许不足以认定，需要再次取材进行检查。
2.染色法
标本经氢氧化钾消化之后，用多种染色方法可以增加直接镜检的敏感性，能够更好的分辨出不同的菌种。如派克墨水或荧光染色法，染色法均比单纯使用氢氧化钾液处理的标本阳性率高。所以，染色法可以与氢氧化钾法同时进行，这样不仅可以使观察到的菌丝和孢子结构更清晰，还可以使观察到的菌丝和孢子与标本中的其它成分相区分。
二、检查灰指甲的免疫组织化学染色法：
1.氢氧化钾液制备标本的方法
采集标本的方法和注意事项，之前已经做了详细的阐述，这里就不重复介绍了。将刮取的甲屑置于清洁的玻璃载片上，加1-2滴10%-20%的氢氧化钾溶液，加盖玻片后微微加热，有助于溶解角蛋白和排出玻片之间多余的气泡，但一定要注意不要过度加热，以免因溶液烧干而形成结晶。待角质层细胞溶开、变薄后即可镜检，在取下的标本中可以找到菌丝和孢子，也可以看见假菌丝或着色的芽胞等。甲屑标本在氢氧化钾液真菌镜检后，根据所见到的不同菌丝、孢子的结构大致可以考虑由某种真菌感染引起灰指甲。有时候，一次镜检或许不足以认定，需要再次取材进行检查。
2.染色法
标本经氢氧化钾消化之后，用多种染色方法可以增加直接镜检的敏感性，能够更好的分辨出不同的菌种。如派克墨水或荧光染色法，染色法均比单纯使用氢氧化钾液处理的标本阳性率高。所以，染色法可以与氢氧化钾法同时进行，这样不仅可以使观察到的菌丝和孢子结构更清晰，还可以使观察到的菌丝和孢子与标本中的其它成分相区分。
来源资料：《中华手外科杂志》 2004年 第4期
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